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响应面优化脂肪酶催化合成三棕榈酸甘油酯

发布日期:2019-07-27 作者: 点击:

响应面优化脂肪酶催化合成三棕榈酸甘油酯



徐坤华1,王东铭2,葛赞1,史立文1,计晓黎1,雷小英1,李伏益1,耿二欢1

     (1.赞宇科技集团股份有限公司,杭州 310030; 2.浙江公正检验中心有限公司,杭州 310030)


摘要:以单因素实验为基础,采用响应面法优化脂肪酶CalB immo Plus在无溶剂体系中催化棕榈酸和甘油酯化反应合成三棕榈酯甘油酯工艺。结果表明:最佳合成工艺条件为反应时间12.8 h、底物摩尔比2.9∶ 1、反应温度75 ℃、加酶量4.4%,在此条件下,酯化率和甘三酯含量分别为95.44%和85.75%。

关键词:脂肪酶CalB immo Plus;三棕榈酸甘油酯;响应面法;酯化

中图分类号:Q814.9;O621.3 文献标识码:A 文章编号:1003-7969(2018)11-0105-05

     


Optimization of lipase-catalyzed synthesis of tripalmitin by 

     response surface methodology

     XU Kunhua1, WANG Dongming2, GE Zan1, SHI Liwen1, JI Xiaoli1,

     LEI Xiaoying1, LI Fuyi1, GENG Erhuan1

     (1. Zanyu Technology Group Co., Ltd., Hangzhou 310030, China; 2. Zhejiang Gongzheng Inspection

     Center Co。, Ltd。, Hangzhou 310030, China)


     Abstract:Based on single factor experiment, the synthesis process of tripalmitin (PPP) from palmitic acid and glycerol by CalB immo Plus lipase catalysis in a solvent free system was optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal synthesis process conditions were obtained as follows: reaction time 12.8 h, molar ratio of palmitic acid to glycerol 2.9∶ 1, reaction temperature 75 ℃ and enzyme dosage 4.4%.Under these conditions, the esterification rate and the triglycerol content were 95.44% and 85.75%, respectively.

     Key words:CalB immo Plus lipase; tripalmitin; response surface methodology; esterification

     

     三棕榈酸甘油酯(PPP),又称三软脂酸甘油酯或棕榈精,是一种重要的甘三酯 [1],被广泛应用于化妆品、食品、制药等领域[2-4]。在化妆品行业中,PPP可用作粉底或片剂的润滑剂,还可作为稠度调节剂、成核剂等[5];在食品行业中,PPP是理想的乳脂添加剂,还能用于食用薄膜[6];在制药行业中,PPP常用作药物转运替代载体[7-9]。此外,PPP还是一种重要的中间体,用于制备1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)等重要的结构脂质[10-12]。目前,甘三酯的制备方法主要有化学法、物理法、微生物法和酶法。化学法需要碱或固体酸作为催化剂,具有产品特异性差、污染严重、后期处理成本高等局限性[13]。物理法主要是通过萃取分离的原理,已有从银杏叶、卫矛等提取的报道[14-15],但产品得率低,且存在有机溶剂残留等问题。Amer等[16]利用Sphingomonas sp. EGY1 DSM 29616菌株发酵34 h后,得到了PPP和三油酸甘油酯(OOO)的混合物,含量达13.8 g/L。发酵法制备甘三酯,产品天然无污染,但含较多的其他代谢产物,且耗时长。而酶法具有很高的选择性和专一性,且反应条件温和,制备的产品纯度高。Yang等[17]利用脂肪酶Novozym-435催化中长碳链脂肪酸与甘油进行酯化反应,在温度90 ℃、加酶量4.80%、脂肪酸与甘油摩尔比3∶ 1、反应时间12.37 h条件下,产物得率可达9354%。Arifin等[18]研究了利用Lipozyme RM IM脂肪酶,酶促催化癸酸、硬脂酸与甘油的酯化反应,得率分别为95.07%、93.15%。Martinez等[19]使用南极假丝酵母脂肪酶催化共轭亚油酸和甘油反应,酯化率可达90%以上。脂肪酶CalB immo Plus是将重组南极假丝酵母脂肪酶吸附固定化在大孔吸附树脂ECR1030M上,降低了固定化酶在机械搅拌时的破碎率,延长了脂肪酶的使用寿命[20]。该酶对众多脂类物质具有较高的催化活性,尤其适用于长链脂肪酸的酶促反应[21-22]。本文利用脂肪酶CalB immo Plus催化棕榈酸和甘油进行酯化反应,并通过响应面法进行工艺优化,为酶促催化合成PPP提供一种新途径。

     1材料与方法

     1.1实验材料PPP标准品(纯度≥99%),三十七烷酸甘油酯标准品(纯度≥99%),三硬脂酸甘油酯标准品(纯度≥99%),购自Sigma-Aldrich(中国); 脂肪酶CalB immo Plus,购自英国Purolite公司;棕榈酸,工业级,购自泰柯棕化(张家港)有限公司;甘油(纯度≥99%),工业级;正己烷,色谱纯;无水硫酸钠,分析纯。7890B 气相色谱仪(配FID检测器),美国Agilent公司;HZQ-F160恒温振荡培养箱;试管涡旋振荡器;AL204分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司。

     1.2实验方法

     1。2。1PPP的合成准确称取(100±0。01)g棕榈酸,在一定的底物摩尔比(棕榈酸与甘油摩尔比,下同)、反应时间、反应温度和加酶量(以棕榈酸的质量计,下同)的条件下,用脂肪酶CalB immo Plus催化棕榈酸和甘油进行酯化反应。反应效果以酯化率(Y)和甘三酯含量(TG)表示。Y=X1m1-X2m2X1m1×100%

(1)式中:X1为样品反应前的酸值(KOH),mg/g;m1为反应前的底物总质量,g;X2为样品反应后的酸值(KOH),mg/g; m2为反应后的底物总质量,g。TG=m甘三酯m总×100%

(2)式中:m甘三酯为反应后样品中甘三酯的质量,g;m总为棕榈酸和甘油的总质量,g。

     1。2。2PPP的含量分析利用气相色谱仪(高温柱)对产物成分进行检测,分析产物中PPP的含量。气相色谱仪分析条件:氢火焰离子化检测器;DB-1ht毛细管柱(30 m×250 μm×0。1 μm);柱初始温度300 ℃,保持3 min,10 ℃/min 升温到350 ℃,保持20 min;进样口温度380 ℃;分流比50∶ 1;检测器温度370 ℃;高纯氮气流速3。0 mL/min,氢气流速35 mL/min,空气流速350 mL/min。

     1.2.3数据处理采用Design Expert 8.0.6软件对实验数据进行显著性检验及方差分析。p<0.05表示具有显著性差异,p<0.01 表示具有极显著性差异。

     2结果与分析

     2.1单因素实验

     2。1。1反应时间的影响在底物摩尔比3∶ 1、反应温度65 ℃、加酶量1%的条件下,研究反应时间对酯化效果的影响,结果见图1。

    

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图1反应时间对酯化效果的影响

由图1可知,随着反应时间的延长,酯化率和甘三酯含量均增加。当反应时间为12 h时,酯化率和甘三酯含量分别为78.69%和68.12%;当继续延长反应时间至16 h后,酯化率和甘三酯含量分别为8605%和75.82%,增长幅度降低;说明反应时间对正反应的贡献率逐渐减小。综合考虑,确定较适宜的反应时间为12 h。

     2.1.2底物摩尔比的影响在反应时间12 h、反应温度65 ℃、加酶量1%的条件下,研究底物摩尔比对酯化效果的影响,结果见图2。

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图2底物摩尔比对酯化效果的影响

由图2可知,当棕榈酸与甘油的摩尔比为2∶ 1~3∶ 1时,酯化率均保持在较高的水平,分别为7668%、78。10%和78。69%。这是由于棕榈酸与甘油进行酯化反应的理论摩尔比为3∶ 1,当摩尔比小于3∶ 1时,过量的甘油会促进酯化反应向正方向进行。因此,酯化率保持在较高的水平。随着底物摩尔比继续增大(摩尔比大于3∶ 1),棕榈酸过量,酯化率逐渐减小。甘三酯含量则随着底物摩尔比的增加呈现先增大后减小的趋势。这是因为在整个酯化反应过程中会产生甘一酯、甘二酯和甘三酯,随着棕榈酸的增加,部分甘一酯和甘二酯转化成了甘三酯;但当棕榈酸过量后,过量的棕榈酸不参加反应,导致了甘三酯在整个体系中的比例减少。因此,确定较适宜的底物摩尔比为3∶ 1。

     2。1。3反应温度的影响 在底物摩尔比3∶ 1、反应时间12 h、加酶量1%的条件下,研究反应温度对酯化效果的影响,结果见图3。

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图3反应温度对酯化效果的影响

由图3可知,随着反应温度的升高,酯化率和甘三酯含量均呈现出先增加后减小的趋势,在75 ℃时均达到最高,分别为87。01%和76。15%。这是因为酶促反应既有普通化学反应的特性,即升高温度可以加快反应速率;但由于酶的本质是蛋白质,升高温度会导致酶变性,在超过适宜反应温度时,反应速率随温度升高的效应将逐渐被酶变性效应抵消,从而导致反应速率下降。因此,确定较适宜的反应温度为75 ℃。

     2.1.4加酶量的影响 在底物摩尔比3∶ 1、反应时间12 h、反应温度65 ℃的条件下,研究加酶量对酯化效果的影响,结果见图4。

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图4加酶量对酯化效果的影响

由图4可知,随着加酶量的增加,酯化率和甘三酯含量增加,当加酶量达到4%时,酯化率和甘三酯含量分别为93.05%和85.88%;当加酶量继续增加至6%时,分别为94.15%和86.98%,增加幅度非常小。因此,确定较适宜的加酶量为4%。

     2.2响应面实验在单因素实验的基础上,采用Design Expert 8.0.6 软件进行响应面设计,以反应时间(A)、底物摩尔比(B)、反应温度(C)和加酶量(D)为自变量,以酯化率(Y)和甘三酯含量(TG)为响应值,设计四因素三水平的响应面实验。响应面实验因素水平见表1,响应面实验设计及结果见表2。

表1响应面实验因素水平

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表2响应面实验设计及结果

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2.2.1酯化率的响应面模型

     2.2.1.1模型的建立和方差分析各因素经回归拟合得到酯化率与反应时间、底物摩尔比、反应温度和加酶量的二次多项式回归模型:Y=93.84+2.65A-5.27B-0.59C+3.54D+0.01AB-0.24AC-3.37AD+0.06BC+1.09BD+0.38CD-1.21A2-4.80B2-0.86C2-2.40D2该模型的方差分析如表3所示。

表3酯化率方差分析

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注:*表示显著,p<0.05;* *表示极显著,p<0.01。下同。

     由表3可知,模型p<0.000 1,极显著;且失拟项p=0.118 0,不显著;说明该回归方程模型达到了极显著的水平,4个因素与酯化率之间的模拟关系是可行的,误差小,可以应用该回归方程模拟代替实验真实点,对实验结果进行数据分析。由表3还可知,一次项A、B和D对酯化率的影响极显著,二次项B2对酯化率的影响极显著,二次项D2对酯化率的影响显著,交互项AD对酯化率的影响极显著。因此,各因素对酯化率的影响比较复杂,不是简单的线性关系。

     2.2.1.2响应面模型分析和最优点的确定利用Design Expert软件进行岭脊分析,得到模型最佳点为:反应时间12.78 h,底物摩尔比2.91∶ 1,反应温度75.1 ℃,加酶量4.39%。

     2.2.2甘三酯含量的响应面回归模型

     2。2。2。1模型的建立及方差分析各因素经回归拟合得到甘三酯含量与反应时间、底物摩尔比、反应温度和加酶量的二次多项式回归模型:TG=84。91+2。48A-4。35B-0。55C+3。32D+0。02AB-0。22AC-3。15AD+0。05BC+1。04BD+036CD-1。13A2-4。55B2-0。81C2-2。25D2该模型的方差分析如表4所示。

表4甘三酯含量方差分析

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由表4可知,模型p<0.000 1,极显著;且失拟项p=0.117 6,不显著;说明该回归方程模型达到了极显著的水平,4个因素与甘三酯含量之间的模拟关系是可行的,实验误差小,即可以应用该回归方程模拟代替实验真实点,对实验结果进行数据分析。由表4还可知,一次项A、B和D对甘三酯含量的影响极显著,二次项B2对甘三酯含量的影响极显著,二次项D2对甘三酯含量的影响显著,交互相AD对甘三酯含量的影响极显著。因此,各因素对甘三酯含量的影响比较复杂,不是简单的线性关系。

     2.2.2.2响应面模型分析和最优点的确定利用Design Expert软件进行岭脊分析,得到模型的最佳点为:反应时间12.78 h,底物摩尔比2.91∶ 1,反应温度75.1 ℃,加酶量4.39%。

     2.2.3响应面模型的验证通过比较可以发现,酯化率和甘三酯含量达到最大值的最佳工艺条件相同。考虑实验的易操作性,选取反应时间为12.8 h,底物摩尔比为2.9∶ 1,反应温度为75 ℃,加酶量为4.4%。在最佳工艺条件下,进行3次平行实验,得到的酯化率分别为9510%、95.68%和95.54%,甘三酯含量分别为85.96%、85.76%和85.54%;酯化率和甘三酯含量平均值分别为95.44%和85.75%;而在该条件下酯化率和甘三酯含量的预测值分别为96.39%,8701%。实验误差小,证明通过响应面模型得到的数据是可行的。

     3结论

利用脂肪酶CalB immo Plus催化棕榈酸和甘油酯化反应合成三棕榈酸甘油酯,并通过响应面法优化,得到最佳条件为:反应时间12.8 h,底物摩尔比2.9∶ 1,反应温度75 ℃,加酶量4.4%。在最佳条件下,酯化率和甘三酯含量的平均值分别为95.44%和85.75%。

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