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无溶剂体系脂肪酶催化合成1,3-丙二醇单酯

发布日期:2018-12-21 作者: 点击:

无溶剂体系脂肪酶催化合成1,3-丙二醇单酯


张 凯1,李 伟1,陈华勇1,王永华2,杨 博1

(1。华南理工大学 生物科学与工程学院,广州 510006; 2。华南理工大学 轻工与食品学院,广州 510006)


摘要:在无溶剂体系中,用脂肪酶Novozyme 435催化1,3-丙二醇和油酸合成1,3-丙二醇单酯,同时确立酯化产物及油酸含量的HPLC-RID检测方法。以1,3-丙二醇单酯最大生成量为目的,初步确定反应最优条件为:1,3-丙二醇和油酸摩尔比6∶ 1,反应温度60 ℃,摇床转速180 r/min,加酶量1%(以1,3-丙二醇和油酸的总质量为基准),反应时间8 h。该条件下产物中的1,3-丙二醇单酯含量达到48.21%。

关键词:无溶剂体系;脂肪酶;1,3-丙二醇;1,3-丙二醇单酯

中图分类号:TQ641;TS218   文献标志码:A   文章编号:1003-7969(2010)08-0028-04


Lipase-catalyzed synthesis of 1,3-propanediol monoester 

in a solvent-free system

ZHANG Kai1, LI Wei1, CHEN Huayong1,WANG Yonghua2 ,YANG Bo1

(1。 School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,

China; 2。 College of Light Industry and Food Sciences, South China University of 

Technology, Guangzhou 510006, China)


Abstract:In a solvent-free system,1,3-propanediol monoester was synthesized from 1,3-propanediol and oleic acid by using immobilized lipase Novozyme 435 as the biocatalyst, and HPLC-RID was developed for determination of the oleic acid content and the reaction products.The content of 1,3-propanediol monoester was used as an index,and the processing parameters were optimized as follows: molar ratio of 1,3-propanediol to oleic acid 6∶ 1, reaction temperature 60 ℃ , shaker rotating speed 180 r/min ,immobilized lipase amount 1%(based on the mass of 1,3-propanediol and oleic acid),reaction time 8 h.Under the optimum conditions, the content of 1,3-propanediol monoester was 48.21%.

Key words:solvent-free system;lipase;1,3-propanediol;1,3-propanediol monoester

    1,3-丙二醇与脂肪酸酯化可生产丙二醇酯,其中1,3-丙二醇单酯是一种良好的油包水型乳化剂,在油墨、涂料、日用化学品等领域有着广泛应用。此外,1,3-丙二醇单酯的3-OH可以与其他C12~C30脂肪酸、营养物、药物基团、生物活性基团等相连[1],形成的化合物在营养保健和生物医药方面有更广阔的应用前景。

    工业上丙二醇酯是在有机溶剂中高温下通过化学催化剂合成的,该工艺产品分离难度大,能耗高;而脂肪酶Novozyme 435生物酶法催化合成丙二醇酯,具有反应条件温和、能耗低、环境友好等优点[2],在产业化方面具有良好的前景。

    生物催化体系中,选择合适的溶剂可提高底物间的传质效率[3]。据文献报道[4,5],在丙二醇酯的酶法合成中,亲脂性的有机溶剂不利于底物1,3-丙二醇的溶解;而亲水性的有机溶剂则会导致反应速率降低。无溶剂体系合成丙二醇酯为反应提供了与传统溶剂不同的新环境,酶直接作用于底物,可提高底物和产物浓度以及反应选择性,同时克服了有机溶剂毒性大,对环境造成污染,回收和循环使用成本高等缺点[6]。

    本研究以1,3-丙二醇和油酸为底物,在无溶剂体系中采用脂肪酶Novozyme 435催化合成1,3-丙二醇单酯,探讨不同因素对其合成的影响,初步优化合成工艺条件。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂

    高效液相色谱仪,Waters 2414型示差折光检测器,Waters 1525型HPLC 泵,Phenomenex Luna 5u silico (2) 100 (250 mm × 4.6 mm)色谱柱,CHZ-82A水浴恒温摇床。固定化脂肪酶Novozyme 435(丹麦诺维信公司),1,3-丙二醇,油酸(分析纯),1,3-丙二醇单酯和1,3-丙二醇二酯(Sigma公司),正己烷和异丙醇(色谱纯)。

1。2 酯化方法

    取一定量的油酸和1,3-丙二醇于250 mL锥形瓶中,加入一定量脂肪酶Novozyme 435(以1,3-丙二醇和油酸体系总质量为基准),然后于不同转速的水浴摇床中反应,定时取样、待测。

1。3 分析方法

1。3。1 HPLC分析条件 流动相V(正己烷)∶ V(异丙醇)=90∶ 10,流速1。0 mL/min,柱箱温度30 ℃,检测器温度35 ℃,进样量10 μL。

1.3.2 标样检测 准确称取质量为m0的1,3-丙二醇单酯标准品,溶解于一定体积的流动相中,在1.3.1 HPLC条件下检测,确定其保留时间,同时记录峰面积(A)。油酸和1,3-丙二醇二酯标准品按同样方法检测,确定其保留时间。

1.3.3 样品检测 准确称取质量为m1的脂肪酶催化反应产物,溶解于一定体积的(与标样体积相同)流动相中,在1.3.1 HPLC条件下检测,根据标样保留时间定性,记录产物中1,3-丙二醇单酯峰面积(A1)。

    酯化反应产物中1,3-丙二醇单酯含量按下式计算:

    ω(1,3-丙二醇单酯)=A1m0/Am1×100%

2 结果与讨论

2。1 酯化产物色谱分析

  酯化产物HPLC-RID检测结果见图1。

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图1 酯化产物HPLC-RID色谱图

    由图1可见,1,3-丙二醇二酯、油酸、1,3-丙二醇单酯保留时间分别为3.240、3.715、6.228 min,游离脂肪酸和酯分离效果较好,7 min可以完成1个样品的检测。说明本文HPLC分析条件可满足实验要求。

2。2 反应条件对1,3-丙二醇单酯合成的影响

2。2。1 反应时间的影响 脂肪酶Novozyme 435催化反应时间过长会影响酶的活力,导致重复利用率低,故实验考察了24 h内酶对1,3-丙二醇单酯合成的影响。在1,3-丙二醇和油酸摩尔比为3∶ 1,摇床转速120 r/min,反应温度50 ℃,加酶量1%条件下,反应时间对1,3-丙二醇单酯含量的影响见图2。

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图2 反应时间对1,3-丙二醇单酯含量的影响

    由图2可见,在0.5~4 h内1,3-丙二醇单酯含量几乎呈线性增长,在4~8 h反应速度有所下降,之后随反应时间的延长,1,3-丙二醇单酯含量增长趋于平缓,体系基本达到平衡。在反应初始阶段0.5~4 h,生成的1,3-丙二醇单酯有助于微乳体系的形成。在微乳体系中,底物油酸和1,3-丙二醇分散更均匀,反应速度更快。随着反应时间的延长,由于底物浓度和酶活力的降低,反应速度逐渐减小。综合考虑反应时间以8 h为宜。

2。2。2 底物摩尔比的影响 在摇床转速120 r/min,反应温度50 ℃,加酶量1%,反应时间6 h的条件下,底物摩尔比对1,3-丙二醇单酯含量的影响见图 3。

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图3 底物摩尔比对1,3-丙二醇单酯含量的影响

    由图3可见,随底物摩尔比的增加,1,3-丙二醇单酯含量也随之增加,在6∶ 1时,达到最大值4620%,再继续增加底物摩尔比,1,3-丙二醇单酯含量在1%左右波动,反应基本达到平衡。由于酶促反应时,首先是脂肪酶与油酸羧基形成酰基酶中间体,同时生成水,然后酰基受体1,3-丙二醇经羟基攻击此亲核中间体,发生酰基转移生成丙二醇酯,脂肪酶同时被释放。当1,3-丙二醇浓度较低时,摇床振荡能使其均匀分散在反应体系中,其浓度增加可促进酯化反应的进行,但是当其浓度满足亲核的酰基酶中间体对受体需求后,即使浓度再增加酯化速度也不会明显提高。综合考虑,较佳的底物摩尔比为6∶ 1。

2.2.3 摇床转速的影响 摇床转速的大小关系到反应体系的传质,选择合适的摇床转速既可以达到所需传质效果,又可以节约能耗,故在1,3-丙二醇和油酸摩尔比为3∶ 1,反应温度50 ℃,加酶量1%,反应时间6 h条件下,考察不同转速对1,3-丙二醇单酯含量的影响,结果见图4。

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图4 摇床转速对1,3-丙二醇单酯含量的影响

    由图4可见,随摇床转速的提高,1,3-丙二醇单酯含量也相应提高,最后变化趋于平缓。可能是转速的提高有效地克服了底物黏度带来的传质阻力,提高了传质效果,使酶周围底物浓度增加,但是当转速继续提高,传质速度不再是影响反应的主要因素,酶和底物自身反应速度成了整个反应的限制因素,因而继续提高转速,1,3-丙二醇单酯含量也无明显提高。综合考虑最佳转速为180 r/min。

2.2.4 反应温度的影响 温度变化直接影响脂肪酶活力以及酶和底物亲和力,进而影响1,3-丙二醇单酯的合成。在1,3-丙二醇和油酸摩尔比为3∶ 1,摇床转速120 r/min,加酶量1%,反应时间6 h条件下,反应温度对1,3-丙二醇单酯含量的影响见图5。

    由图5可见,在30~60 ℃范围内,1,3-丙二醇单酯含量随温度升高逐渐增加,说明脂肪酶活力随温度升高逐渐增加,同时温度提高也降低了无溶剂体系黏度,间接提高了传质效果。60 ℃下1,3-丙二醇单酯含量达到46.06%。当温度继续升高到70 ℃时,1,3-丙二醇单酯含量有所降低,可能是温度过高酶空间结构发生改变,导致酶活力受到影响,催化效率降低。综合考虑反应温度以60 ℃为佳。

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图5 反应温度对1,3-丙二醇单酯含量的影响

2.2.5 加酶量的影响 在1,3-丙二醇和油酸摩尔比为3∶ 1,摇床转速120 r/min,反应温度50 ℃,反应时间8 h条件下,加酶量对1,3-丙二醇单酯含量的影响见图6。

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图6 加酶量对1,3-丙二醇单酯含量的影响

    脂肪酶作为高效催化剂,其添加量对酯化反应起关键作用。由图6可以看出,加酶量在0。25%~1。0%之间时,随加酶量的增加,1,3-丙二醇单酯含量得到提高,可能是加酶量增加提高了底物周围酶浓度,加速了底物油酸和1,3-丙二醇的酯化速度;加酶量超过1%之后,随着加酶量的增大,1,3-丙二醇单酯含量变化不大,可能是酶活性基团和底物嵌合达到饱和,或者是酶不能完全悬浮,造成乳化界面减少,传质受限所致。脂肪酶Novozyme 435成本较高,从经济和催化效果综合考虑,最佳的加酶量为1%。

3 结 论

    通过脂肪酶Novozyme 435催化油酸和1,3-丙二醇反应合成1,3-丙二醇单酯条件的研究,确定1,3-丙二醇单酯最大生成量的优化条件为:1,3-丙二醇和油酸摩尔比6∶ 1,反应时间8 h,摇床转速180 r/min,反应温度60 ℃,加酶量1%。在此条件下,产物中1,3-丙二醇单酯含量达到48。21%。同时确立了油酸和酯化产物HPLC-RID检测方法,7 min可完成1个样品的分析。


参考文献:

[1] 霍尔罗宾 D F,曼库 M.作为生物活性化合物的1,3-丙二醇衍生物:中国,96195062.5[P]. 1998-07-29.

[2] 李秋生,余若黔,杨博.固定化脂肪酶的应用研究进展[J].四川食品与发酵,2003,39(2):10-12.

[3] KUO S J, PARKIN K L。 Solvent polarity influences product selectivity of lipase-mediated esterification reactions in microaqueous media [J]。J Am Oil Chem Soc,1996,73:1427-1433。

[4] CHEVANDIER F, DUBREUCA E, GALZY P. Lipase catalysed synthesis of propanediol monoesters in biphasic aqueous medium[J].Biotechnology Letters,1997,19(9):913-917.

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